你生物学研究的好伙伴
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外泌体是由活细胞分泌到细胞外空间的囊泡，直径30-150 nm，密度1.13-1.19 g/mL。人体中几乎所有类型的细胞都会产生外泌体，每个细胞的外泌体数量接近1000-10000。它们具有典型的脂质双分子膜结构，存在于各种生物液体中，包括细胞培养上清、血浆、血清、唾液、尿液、羊水、恶性腹水等生物液体中。在本文中，我们收集了以下几个关于外泌体的主题:
在此，我们从外泌体研究的三个主要突破来介绍外泌体的研究历史。第一个突破始于外泌体的发现。
1986年，Eberhard G.Trams和R.M,Johnstone在体外培养的绵羊红细胞培养上清中首次发现了一个具有膜结构的小泡，并将其命名为外泌体。在接下来的10年里，外泌体并没有得到足够的重视。然而，1996年，Rapose等人报道了ev的功能，明确B淋巴细胞通过释放含有II型主要组织相容性复合体(MHC) II的外泌体诱导抗原特异性MHC II类限制性t细胞应答。这是外泌体领域的第一个重大突破。
从那时起，研究人员对外泌体产生了极大的好奇。2007年，Jan Lotvall等人创造了外泌体研究的第二次突破，即外泌体中包含的可变RNA和miRNA，非编码长RNA和mrna可以在细胞之间运输。2010年，三个研究小组证明这些miRNAs可以转移到备用细胞并在细胞中发挥作用。
第三个突破是2013年诺贝尔生理学或医学奖授予了美国科学家詹姆斯·罗斯曼(James E. Rothman)和兰迪·w·谢尔曼(Randy W. Schekman)以及德国科学家托马斯·c·苏德霍夫(Thomas C. Sudhof)。他们发现细胞内囊泡转运的调控机制将外泌体的研究提升到一个新的高度，成为近年来生物医学领域的研究热点[1] [2]．
外泌体的形成是一个连续的过程。首先，细胞外物质或细胞膜蛋白通过内吞作用形成早期内小体，并通过细胞内运输逐渐成熟为晚期内小体。在一定的生理或病理条件下，晚期核内体的边界膜向内凹陷形成多囊体(MVBs)。20多种囊泡分选蛋白参与MVBs的形成。其中最重要的是四个运输所需的内体分选复合体(ESCRT)和液泡蛋白soaing 4 (Vps4)。MVBs可以与溶酶体融合，并通过溶酶体降解将内容物排除在细胞外。腔内囊泡(ILVs)也可以内出芽的形式与细胞膜直接融合，通过ESCRT III收缩剪芽颈脱落，释放到细胞外环境中形成外分泌体[3]．如图1所示。
图1。ilv是由内陷体膜产生的，有三种可能的命运
释放到间质细胞的外泌体会通过内吞作用或配体-受体识别方式再次进入受体细胞，并将“货物”释放到受体细胞质中发挥信号转导作用。它们还可以更新MVBs或直接与细胞质膜融合，为下一个周期做准备[4]．如图2所示。
图2。外泌体被受体细胞摄取。
图3。外泌体的结构
外泌体外膜富含胆固醇、鞘脂、神经酰胺、糖脂GM3和长饱和脂肪酸基的甘油磷脂链，在细胞微环境中发挥重要作用。它广泛分布于各种体液中。类似的保守蛋白，如MHC I，热休克蛋白，四跨膜蛋白(CD9，CD63，的研究阿历克斯,次数101)、整合素、细胞骨架蛋白和一些生物异型细胞[5] [6] [7]．这些蛋白质也被称为外泌体标记物。外泌体包含生物信息，比如胆固醇，蛋白质,信使rna。这些物质不仅反映其来源的细胞类型，更重要的是，它们与来源细胞的生理功能或病理变化密切相关。
来自不同细胞的外泌体在不同的生理和病理阶段具有不同的功能。目前已知的外泌体功能包括以下两个方面。就母细胞而言，其主要作用是质量控制、细胞内有害物质的选择性释放、维持细胞内稳态和细胞活力。对于受体细胞而言，外泌体作为多种信号的传递者，介导细胞与细胞之间的信息交换，可以密切影响相邻细胞或系统地远距离调节相邻细胞。
外泌体携带蛋白质、miRNAs、lncRNAs、circRNAs、mrna及其降解片段参与细胞内信号转导，参与细胞活性的重要调控。此外，新的证据发现，外泌体在免疫调节机制、疾病发展、阿尔茨海默病、肿瘤转移等方面发挥作用，是治疗免疫疾病等疑难疾病的一线诊断标志物。
在所有癌症中，癌细胞与其微环境的相互作用是肿瘤发生、发展和对治疗反应的一个不可避免的方面。这种双边交易也是产生耐药性的关键情况，在许多情况下最终决定疾病的命运和生存。外泌体，也被称为细胞外囊泡(EV)的一类，在过去几年中已经被证明是细胞与细胞之间局部和远程接触的重要媒介，通过引入其蛋白质、非编码rna和膜相关小分子的含量来改变其靶细胞的活性[8]．
最近，大量的证据表明，外泌体在癌症中起着至关重要的作用。例如，Zheng R的团队已经证明，来自正常细胞的外泌体通过将PTENP1转移到膀胱癌(BC)细胞，在体外和体内都可以减少BC的进展。结果提示，外泌体PTENP1参与BC癌变过程中正常细胞到膀胱细胞的信息传递。外泌体PTENP1是一种很有前途的新型生物标志物，可用于临床检测BC[9]．除了膀胱癌，桑托斯·JC，等．发现外泌体通过转移miR-155介导乳腺癌化疗耐药[10]．此外，在三阴性乳腺癌细胞中，缺乏对PLD表达和外泌体生物发生的有效翻译调控[11]．
此外，外泌体在其他癌症中也有关键作用，如胰腺癌、前列腺癌、胃癌等[12] [13] [14]．
阿尔茨海默病(AD)的特点是突触传递的改变，认知能力下降，神经元死亡，通过神经元纤维缠结和淀粉样蛋白(Aβ)在脑实质的积累。目前，还没有可行的治疗方法来减缓或逆转AD的进展。近年来，有多项研究表明AD与外泌体的关系[15] [16]．Perez-Gonzalez等．已经报道a β加工与内小体隔室有关，a β和c末端片段的一部分与外泌体有关[17]．此外，AD中上调的外泌体分泌也被证明是通过初级星形胶质细胞在Ab暴露时分泌外泌体，这一过程依赖于中性鞘磷脂酶2 (nSMase2)生成神经酰胺。[18]．外泌体已经在Aβ的胞外酶降解中被提及[19]．如果您想了解更多详情，请点击在这里或留个口信给我们。
除了这两种疾病外，越来越多的证据表明它在其他疾病中的作用。
应W,等，加州大学圣地亚哥分校内分泌代谢医学学系的研究人员发现，脂肪组织巨噬细胞来源的外泌体miRNAs可以调节体内和体外胰岛素敏感性。这些miRNAs可通过旁分泌或内分泌调节机制转移到胰岛素靶细胞类型，对细胞胰岛素作用、体内胰岛素敏感性和整体葡萄糖稳态产生强大的影响[20]．该论文的通信作者Jerrold Olefsky博士说:“当外泌体在组织间迁移时，它们诱导的反应可能是导致糖尿病代谢紊乱的细胞间通信的一个主要原因。通过荧光标记细胞，我们能够观察到外泌体和它们携带的microRNAs (miRNAs)从脂肪组织通过血液进入肌肉和肝脏组织。”
此外，李颖，等．中国北京首都医科大学口腔医学院的研究人员在裸鼠皮下移植12周后进行的动物研究表明，ssc-mir-133b的异位表达导致牙齿形成失败。牙齿胚芽发育异常，没有必不可少的外泌体信号从下颌骨[21]．
如外泌体与疾病部分所述，外泌体在免疫调节机制、疾病发展、阿尔茨海默病、肿瘤转移等方面发挥着关键作用。因此，一种名为外泌体疗法的治疗方法出现了。如果这项技术想要发展，获得大量高质量的外泌体是一个亟待解决的问题。在这里，我们收集了几种常规的分离外泌体的方法，并基于这些方法开发了外泌体分离试剂盒。
超离心(也称微分离心)是最常用的外泌体纯化方法。采用低速离心和高速离心两种方式，可分离出大小相近的囊泡颗粒。
超解离法因操作简单，获得的小泡数量多而广受欢迎。但是这个过程比较耗时，而且回收率不稳定。这可能与转子的类型有关。此外，获得的外泌体的纯度也受到质疑。此外，反复离心会损坏囊泡，从而降低其质量。
密度梯度离心是一种区域分离方法。蔗糖溶液在超离心力的作用下形成由低到高连续分布的密度层。通过密度梯度离心，将样品中的外泌体在1.13-1.19 g/ml的密度范围内富集。该方法获得的外泌体纯度高，但步骤繁琐、耗时，且对离心时间极为敏感。
色谱法是一种基于凝胶孔隙大小与样品尺寸之间的相对关系来分析溶质分离的方法。样品中的大分子不能进入凝胶孔隙，只能通过多孔凝胶颗粒之间的柱，首先被流动相洗脱。小分子可以进入凝胶中的大部分孔隙，在色谱柱中受到的影响更大。保留力强，洗脱较慢。分离的外泌体在电子显微镜下大小均匀，但需要特殊的设备，并没有广泛使用。
磁珠免疫分析法，也被称为抗体亲和法，是一种将涂有抗标记抗体的磁珠与外泌体囊泡孵育，以吸附和分离外泌体的方法。
磁珠法特异性高，操作简单，不影响外泌体的形态完整性，但效率低，且外泌体的生物活性容易受pH和盐浓度的影响，不利于下游实验，难以广泛推广。
聚乙二醇(PEG)是一种常用的聚合物，可与疏水蛋白和脂类分子共沉淀。它以前用于从血清等样本中收集病毒，现在用于沉淀。外泌体的原理可能与与自由水分子的竞争性结合有关。
与目前最常用的超离心法相比，该工艺效率较高，回收率较好。但是，这两种方法在获得的外泌体纯度方面存在相同的障碍。这个问题也是外泌体研究进展的最大难点。要实现外泌体治疗，我们还有很长的路要走。
还有另一种获取外泌体的方法:CUSABIO外泌体分离试剂盒．
参考文献
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