纳米体，多么强大的新型抗体!

1.纳米体是如何被发现的?

2.Nanobody是什么?

3.什么是纳米体的生产?

4.纳米体的优点是什么?

5.纳米体有哪些应用?

6.纳米体在SARS-CoV-2治疗中的最新研究进展

1.纳米体是如何被发现的?

纳米体具有分子量小、分子结构独特等特点。这些特点使其适用于疾病诊断和治疗等多个领域。

纳米体在20世纪80年代被发现。两名大学生向哈默斯(比利时布鲁塞尔自由大学免疫学教授)抱怨说，学校安排的实验课程的结果是众所周知的，没有挑战性。所以哈默斯教授把冰箱里剩下的半升给穆尔德曼等人研究昏睡病的骆驼血，并让他们尝试从骆驼血中提纯骆驼抗体。穆尔德曼斯和其他人惊讶地发现，从骆驼血液中提纯的一些抗体并不属于所有脊椎动物的标准类型，而是一种全新的、更简单的变体抗体。这个结果让每个人都感到困惑。哈默斯立即成立了研究小组，对该抗体进行了专门研究。从那时起，骆驼抗体迅速从一个学生的实验发展到哈默斯和同事研究的主要项目。1993年，Hamers等人首次在《自然》杂志上报道，骆驼和鲨鱼体内存在一种天然缺乏轻链的重链抗体(HcAb)^[1]．与传统单克隆抗体相比，重链可变区和铰链区之间除了缺少一条轻链外，没有CH1区域，只有一个重链可变区(VHH)和两个传统的CH2和CH3区域。VHH就是所谓的纳米体。对于纳米体的结构，我们将在下一节介绍。

2.Nanobody是什么?

纳米体(Nbs)，也被称为VHH抗体，是位于重链上的单一可变域的抗体，来源于羊驼重链IgG抗体(HCAb)。Nbs通常被视为传统抗体的替代品，在生产和使用方面存在显著差异，影响其适用性。Nbs与传统抗体的主要区别在于其结构和作用域。如图1所示，传统抗体有两个可变的区域，称为VH和VL，它们相互提供稳定性和结合特异性。Nbs具有VHH结构域，缺乏VL结构域，但仍然高度稳定。缺少VL结构域也意味着Nbs具有亲水的一面。

重链抗体的VHH片段不同于传统抗体的VH特性，但单独克隆表达的VHH结构具有相当于原重链抗体的结构稳定性和与抗原的结合活性，是目前已知的结合靶抗原的最小单位^[3]．结构分析结果表明，VHH晶体宽2.5nm，长4.8nm，分子量仅为15KDa左右。

3.什么是纳米体的生产?

纳米体(Nbs)作为研究试剂越来越受欢迎，文献中出现了大量利用Nbs的论文。2018年9月3日，EMA批准了赛诺菲纳米体药物(Caplacizumab，又称Cablivi)用于成人获得性血栓性血小板减少性紫癜(aTTP)的治疗。Cablivi成为首个特异的aTTP治疗药物和首个上市的纳米体药物。

随着首个纳米体药物的获批，如何大规模生产稳定的Nbs成为亟待解决的问题。目前，免疫库是生产Nbs最常见的选择。如图2所示，基因信息可以通过使用免疫原或使用未免疫的骆驼科动物(如骆驼、单峰骆驼、美洲驼或羊驼)通过采集含有淋巴细胞的血液来获得。将特定序列扩增并插入克隆载体后，通过噬菌体展示技术，或采用细胞表面展示、mRNA/cDNA展示、MS光谱鉴定等方法筛选最合适的Nbs^[4]．进行这类筛选最常用的策略是基于噬菌体显示选择。

4.纳米体的优点是什么?

纳米体(Nanobodies, Nbs)的独特特性与传统抗体相比具有显著优势。它们结合了单克隆抗体的理想特性和小分子药物的一些有益特性。

• Nbs性质非常稳定，在高温条件下保持生物活性，易于运输和储存。而且，Nbs在强酸、强碱条件下具有稳定性，可以制备口服制剂，而传统抗体在高温、强酸、强碱条件下容易分解，需要低温保存^{[5] [6]}；
• 由于其结构特点，Nbs可以深入抗原^[7]，这样它们就能识别出传统抗体无法识别的抗原;
• Nbs非常小，可以进入肿瘤组织内部彻底切除肿瘤，也可以通过血脑屏障进入脑组织^[8]．传统抗体的分子量是Nbs的10倍，组织通透性差;
• Nbs结构简单，可在大肠杆菌、酵母等较为简单的微生物系统中大规模生产，大大降低了研发和生产成本，解决了抗体产品大规模制备的问题。

然而，在体外诊断试剂方面，Nbs还存在一些障碍。由于Nbs分子量小，在应用于临床诊断试剂盒开发之前，需要对其结构进行修饰。然而，目前常用的结构修饰技术会对Nbs的生物活性产生负面影响，从而严重制约了纳米体产品的应用。

5.纳米体有哪些应用?

Nbs有许多有趣的应用程序，其中许多还处于开发的早期阶段。这些应用包括从基础研究到临床治疗。这些应用主要分为三个部分，包括研究、诊断和治疗。

纳米体在研究中的应用

• Nbs作为亲和捕获试剂:与较大的抗体格式相比，Nbs体积小、结构域单一，具有更高的容量结合表面和更低的非特异性背景结合^[9]．由于其单价结合模式，它们可以在温和的条件下洗脱，其高稳定性允许重复使用^[10]．
• Nbs作为结晶伴侣:由于Nbs能够将蛋白质锁定在特定的构象中，稳定柔性结构域，并保护聚集表面不受溶剂的影响，因此它作为伴侣在结晶具有挑战性的蛋白质方面表现出良好的记录^{[11] [12]}．它们已被用于许多蛋白质结晶研究，同样的特性也被用于稳定淀粉样-β原纤维和防止成熟淀粉样原纤维的形成。
• 细胞内靶成像和免疫调节:在活细胞内起作用的抗体称为“体内抗体”。即使在细胞内还原的环境中，Nbs也能很好地融入功能实体中，在细胞内与荧光蛋白融合表达，这种荧光蛋白可用于跟踪其抗原在活细胞中的活动^[13]．它们还可用于功能性地敲除细胞内的抗原，并与信号肽融合以靶向特定的亚细胞区隔。

纳米体在诊断中的应用

• Nbs作为新型生物传感器探针:Nbs可用于医学、环境、食品分析等领域的生物传感器。它们的特定位点的功能图案很容易引入，而且它们的小尺寸允许高容量的结合表面，从而导致更高的灵敏度。
• Nbs用于无创活体成像:由于Nbs体积小，可以快速穿透组织和清除血液，因此可作为研究疾病过程的无创分子成像示踪剂。

纳米体在治疗中的应用

• 抗蛇毒血清治疗中的Nbs:目前，多克隆免疫球蛋白片段被用于生产效力低、效力不稳定的抗蛇毒血清。此外，它们还具有严重的不良影响。Nbs的小尺寸使它们能够以生物分布的方式在体内扩散，这与小的毒液毒素相匹配，在纳米体捕获毒液后，复合物仍然足够小，可以被肾脏迅速清除。
• 国家统计局对感染:Nbs可被开发为一种抗细菌、病毒和寄生虫感染的制剂。Nbs针对呼吸道合胞病毒的一期临床试验表明，Nbs具有抗感染的作用。Nbs缺乏传统抗体的Fc区，因此不能中和和消除病原体。然而，它们有其固有的中和作用。
• 免疫治疗学中的Nbs:Nbs可通过抑制配体-受体相互作用来对抗癌症和其他疾病，如拮抗抗血管性血友病因子以阻断血栓形成的起始，或抑制抗tnf -α治疗关节炎。

6.纳米体在SARS-CoV-2治疗中的最新研究进展

在本节中，我们收集了纳米体在SARS-CoV-2治疗中的几个最新进展，如下:

• 2020年5月5日，杰森·s·麦克莱伦等．发表了一项题为“细胞上单域驼峰抗体有效中和β冠状病毒的结构基础”的研究。研究发现，从用预稳定冠状病毒刺突免疫的大羊驼中分离出单域抗体(VHHs)。这些VHHs分别中和MERS-CoV或SARS-CoV-1 S伪型病毒。该研究还表明，SARS-CoV-1 S-定向VHH和SARS-CoV-2 S之间的交叉反应性，并表明这种交叉反应的VHH以二价人IgG fc融合体的形式中和SARS-CoV-2 S伪病毒。这些研究结果为VHHs中和致病性乙型冠状病毒提供了分子基础，并表明这些分子可能在冠状病毒暴发期间作为有用的治疗手段^[14]．
• 2020年5月14日，复旦大学科研人员在《中国日报》网络版发表《人类抗新冠病毒单域抗体鉴定》细胞宿主和微生物．研究人员已经成功建立了噬菌体展示的人类单域抗体库。该多功能平台可快速分离人类纳米体(Nbs)和筛选SARS-CoV-2抗体。Nbs不仅可以单独使用，也可以与其他抗体配合使用;体积小的特点也成为双特异性或多特异性抗体的理想组成部分，有效防止病毒逃逸突变等诸多优点的出现。因此，这些全人纳米体有望开发成为临床治疗COVID-19的有效预防和治疗药物^[15]．
• 2020年6月6日，中国科研团队在美国《纽约时报》网站发表了《有效预防新冠肺炎的候选灭活疫苗BBIBP-CorV的研制》细胞．他们报告了一种灭活SARS-CoV-2候选疫苗(BBIBP-CorV)的中试规模生产，该疫苗在小鼠、大鼠、豚鼠、兔子和非人类灵长类动物中诱导高水平的中和抗体滴度，以提供对SARS-CoV-2的保护。此外，BBIBP-CorV具有高效的生产效率和良好的遗传稳定性，可用于疫苗生产。这些结果支持在临床试验中进一步评价BBIBP-CorV^[16]．

参考文献

哈默斯-卡斯特曼，阿塔霍赫，等．无轻链的天然抗体[J]。大自然。1993年,363:446 - 448。

[2] j - pablo Salvador & Lluïsa Vilaplana。纳米材料在诊断和治疗中的应用[J]。Bioanal化学》2019。

李翠，唐卓然，等．天然单域抗体-纳米体:抗体领域的新概念[J]。生物纳米技术。2018。14:1-19。

刘伟，宋浩，等．抗原特异性纳米体的筛选与鉴定研究进展[J]。高分子学报，2018,96:37 - 47。

佩雷斯JM，雷尼西奥JG，等．羊驼抗体片段的热展开:双态可逆过程[J]。生物化学。2001年,40(1):74 - 83。

Dumoulin M, Conrath K，等．高构象稳定性的单域抗体片段[J]。ProteinSci。2002年,11(3):500 - 15所示。

张志强，刘志强，等。基于β -内酰胺酶抑制剂的生物信息学研究[J]。抗微生物药物化学。2001,45(10):2807-2812。

麦克墨菲T，肖R，等．瘦素受体纳米颗粒在黑色素瘤小鼠模型中的抗肿瘤活性[j]。科学通报，2014,9(2):e89895。

Verheesen P, Ten Haaft MR，等．单域抗体片段在免疫亲和纯化和免疫灌注层析中的应用[J]。Biochim。Biophys。学报，2003,1624(1-3)，21-28。

Gholamreza HassanzadehGhassabeh, Nick Devoogdt，等．纳米材料及其应用前景[J]。纳米医学。2013,8(6):1013-1026。

Baranova E, Fronzes R，等．SbsB结构和晶格重构揭示了Ca2+触发的s层组装。大自然。2012,487(7405):119 - 122。

Rasmussen SGF, Choi H-J，等．β(2)肾上腺素受体纳米结构稳定的活性状态[J]。自然学报，2011,469(7329):175-180。

里斯J，卡普兰C，等．一种基于gfp的纳米体超分辨显微复制方法[J]。方法。2012,9(6)，582-584。

Daniel Wrapp, Dorien De Vlieger，等．[J].安徽农业大学学报(自然科学版)。地球物理学报，2000,21(5):732 - 732。

吴艳玲，李成，等．人抗SARS-CoV-2单域抗体的鉴定[J]。细胞宿主与微生物。2020,27(6):891-898。

王辉，张云涛，等。新型SARS-CoV-2灭活疫苗的研制[J]。细胞。2020。