ELISA数据分析

-指导ELISA标准曲线的绘制和靶蛋白浓度的计算

ELISA法用于测定生物样品中目的蛋白的浓度。三个类型的ELISA得出数据输出。

定量:用一系列稀释的标准蛋白和相应的已知浓度的ODs可以生成一条标准曲线。酶联免疫吸附试验(ELISA)的数据可以从标准曲线内插，计算出样品中目标蛋白的浓度。
定性:我们只是简单地得到一个阴性或阳性的结果，以确定是否有任何目标蛋白存在于某一样品与阴性对照比较。
半定量:这种类型的酶联免疫试剂盒，我们可以得到阴性或阳性的结果，并比较分析样品中的目标蛋白水平，因为样品的吸光度水平将直接对应于目标蛋白浓度的水平。但是，由于试剂盒中没有任何标准蛋白，我们无法计算出准确的浓度。

一般来说，使用定量ELISA试剂盒，你可以定量样品中的目标蛋白，因为你需要测试一系列已知浓度的标准蛋白。当你用定量ELISA试剂盒分析ELISA数据时，你必须画出平均吸光度与蛋白质浓度的曲线，并画出最适合你的标准结果的曲线，然后将样品的吸光度插值到曲线上计算浓度。本ELISA标准曲线程序将全面指导如何用定量ELISA试剂盒一步一步计算ELISA结果。

首先，你需要按照我们的排板指南运行ELISA试剂盒，从ELISA阅读器中获取原始数据，然后进入下一步，对ELISA结果进行统计分析，这是最后一步，也是关键一步，得到你的样品中目标蛋白的浓度。我们推荐您使用简单的ELISA数据分析软件曲线专家1.3或曲线专家1.4，您可以在本页末尾下载，进行数据处理计算。市场上还有很多其他的曲线拟合软件可以用来进行ELISA计算，比如GraphPad棱镜也可以使用普通的MS Excel进行分析。

ELISA数据分析的处理分为三个步骤。

将标准品的ELISA数据输入软件
选择最佳拟合曲线
用插值法计算目标蛋白浓度

下面我将一步一步地向大家展示如何制作ELISA标准曲线。

你也可以先看看这个视频。

1.将标准品的ELISA数据输入软件

酶联免疫吸附试验完成后，可以将原始数据分成三部分。建议运行标准和样品为一式两份或三份。作为最佳实践，您最好将重复CV控制在8%以下。

第1部分:已知浓度标准品的吸光度
第二部分:空白井/背景的吸光度
第三部分:未知浓度样品的吸光度

标准品连续用样品稀释液稀释。样品也可能需要稀释。由于样品稀释剂即使在检测波长没有蛋白存在时也有吸光度，所以我们在空白孔中加入样品稀释剂以获得背景OD值。通常的做法是用标准品和所有样品的吸光度减去空白孔的吸光度。

取人TNF-α ELISA kit (CSB-E04740h)作为一个例子。用减去空白孔外径的方法来校正标准品和样品的吸光度。

这里我们以“曲线专家1.4”为例，向您展示该软件的操作和数据分析过程。

1.1启动曲线专家1.4。您可以在下面看到一个界面。

1.2输入标准品OD值(x轴)及对应浓度(y轴)。您可以将excel表格中的数据直接复制到软件中的工作表中。数据图显示在右下角。

2.选择最佳拟合曲线

2.1点击[运行按钮，让软件检查您的数据，选择最佳可能的曲线拟合。选择要包含在计算中的模型族。通常，我们点击[都在包括所有的模范家庭。如果要考虑多项式族，则必须在“多项式约束”区域指定软件将考虑的多项式的最大次数。我们建议将多项式的最大次数设为“4”。当然，如果不包含多项式族，多项式约束将被忽略。然后按[好吧]。

2.2然后进行计算，根据每条曲线的标准误差和相关系数对其进行排序，并在绘图窗口中显示出最佳的拟合曲线。

虽然软件会推荐最佳拟合曲线，但您仍然可以通过双击不同的回归来手动选择曲线。选择r值最接近1的曲线。

双击不同的回归

错误的ELISA曲线

对ELISA曲线

选择合适的曲线拟合回归是很重要的，因为样品的浓度将根据标准曲线计算。下图说明了不同的ELISA标准曲线对浓度计算精度的影响。r值越接近1，说明OD与浓度的相关性越强。

这是一个向您展示不同标准曲线如何影响结果的例子。如果测试样品的吸光度为1.4，则线性曲线(r= 0.92255796)和非线性曲线(r= 0.99993479)计算出的两种浓度差异较大(199.955 VS 114.898)。

在本例中，我们最终选择了“有理函数”，因为与其他标准曲线相比，它的“r”值最接近“1”。通过按下鼠标右键或在任何绘图窗口中按下Ctrl-M，您可以从绘图菜单中进行选择。通过单击[复制按钮，您可以粘贴标准图形到excel表格或word文档。

3.用插值法计算目标蛋白浓度

如何计算浓度?你有两种方法来计算目标蛋白的浓度。

在软件中分析ELISA数据。

通过从绘图菜单中选择Analyze或按Ctrl-L，该软件可以轻松地定位x/y点、区分和集成曲线拟合。在这个例子中，我们想通过在给定的OD (X值)上评估曲线拟合来找到目标蛋白的浓度(Y值)。只需在“at x =”字段中输入您想要评估曲线拟合的点(x值)，然后按[计算]或[输入]。计算器将显示相应的y值。